rt-PCR을 이용한 신속검출 실험레포트

1. Title

rt-PCR을 이용한 할랄식품에서 haram 성분의 신속검출

 

 

2. Abstract

Real-time PCR(rt-PCR)은 증폭되는 유전자의 양을 실시간으로 검출하여 정량분석을 하는 실험법이다. 증폭 산물을 처음으로 검출할 수 있는 threshold를 넘는 지점의 cycle 수인 Ct 값을 토대로 결과를 확인할 수 있다. Real-time PCR에는 SYBR Green 형광 삽입체를 넣어 형광물질을 정량 하는 intercalator method와 형광물질과 소광물질을 가지고 있는 probe를 삽입하는 probe method가 있다. 소고기와 닭고기는 전세계 인구의 25%를 차지하고 있는 무슬림이 먹고 쓸 수 있는 제품인 할랄식품이며, 돼지고기는 무슬림에서 금지된 제품인 하람이 포함된다. 이번 실험에서는 TaqMan probe method를 통해 식품에 함유된 돼지, 소, 닭고기 성분을 검출하였다. 돼지는 sus, 소는 bos, 닭은 cox probe를 넣어주었다. 영양성분함량에 적혀 있는 것과 동일하게 식품들이 검출되었다. 그러나 여기에서의 Ct값은 상대적인 값으로 실제 함량과는 차이가 있으며 보존제 등에 의해 결과가 달라질 수 있다.

 

 

3. Introduction

1) Real-time PCR (원리, 방법 여러개)

 (1) 원리

 Real-time PCR은 일반적인 PCR과 가장 큰 차이점은 정량 분석이 가능하다는 것이다. 유전자의 수가 기하급수적으로 증가하는 구간에서 증폭되는 유전자의 양을 실시간으로 검출하여 그래프로 작성한다. PCR 증폭 산물량이 형광으로 검출할 수 있는 양이 되면 증폭 곡선은 급격히 상승하여 일정 반응 후에 정체기에 도달한다. 처음 증폭 산물을 검출할 수 있는 Threshold를 넘는 지점의 Cycle 수를 Ct 값이라고 하며, Ct 값은 초기 DNA양과 반비례한다. 초기 DNA 양이 많으면 증폭을 적게 시켜도 검출이 되고, 초기 DNA 양이 적으면 증폭 횟수가 많아야 검출 한계를 넘는다.

 

 (2) DNA 이중가닥 삽입체 형광측정법

 PCR 과정에서 증폭되는 DNA에 결합되는 형광 삽입체(intercalator)의 농도를 측정하는 방법으로 3단계로 이루어진다. 이 검출법에서는 일반적으로 SYBR Green을 많이 사용한다. 이 형광체는 PCR의 denaturation 단계에서 생성된 단일가닥 DNA(ssDNA)에는 결합하지 않고, primer 결합 이후 extension이 되면서 형성된 이중가닥 DNA(dsDNA)에는 선택적으로 결합하여 형광을 발한다. 이 형광 강도를 측정하여 증폭된 PCR 산물의 양을 실시간으로 정량할 수 있다. 따로 서열 design이 필요하지 않으며 primer만 필요로 한다.

 

 (3) DNA 서열 특이적 탐침(probe) 이용 형광측정법

 PCR 반응에 사용되는 한 쌍의 프라이머 조합에 추가하여, 증폭하려는 특정 염기서열에 특이적인 형광 탐침(probe)을 반응에 이용하는 실험법이다. 이 탐침의 5' 말단에는 형광물질(F)이 부착되어 있고, 3' 말단에는 형광을 상쇄하는 소광물질(Q)가 부착되어 있다. Annealing 단계에서 target 부위에 특이적으로 결합하지만 상쇄물질로 인해서 발하지 못하다가 다음 과정인 extension 단계에서 DNA polymerase의 exonuclease 활성으로 인해 주형 DNA에 결합된 탐침이 가수분해 된다. 이때 형광물질이 형광을 발광하며, 형광량을 측정하여 타겟 유전자의 증폭량을 정량한다. 형광물질로 사용되는 형광 dye들은 여러가지 종류가 있는데 각각은 고유의 빛을 흡수하는 excitation 파장과 고유의 빛을 발산하는 emission 파장을 가지고 있다. 사용하는 real-time PCR 장비에 따라서 적절한 형광 dye를 제작하여야 한다. 이 형광측정법에 널리 사용되는 방법은 oligonucleotide primer를 이용한 TaqMan probe법이다. 그 외에 RNA probe와 RNase H를 조합한 고감도 검출법으로 증폭 중이나 증폭 후의 유전자 단편의 특정 서열을 높은 효율로 검출하는 cycling probe법 등이 있다.

 

2) 할랄, 할랄식품

‘할랄’이란 이슬람교도인 무슬림이 먹고 쓸 수 있는 제품을 말하며, 아랍어로 ‘허용된’이라는 뜻을 나타낸다. 무슬림은 인구가 세계인구의 25%를 차지하며 무슬림 문화권은 동일한 종교를 기반으로 동질성이 강한 거대시장을 형성하고 있다. 할랄식품은 칠면조 등 육류, 모든 생선과 해산물, 견과류, 채소나 과일, 곡물이다. 또한 대표적으로 금지된 식품인 하람은 돼지고기, GMO 등이 있다. 세계 식품 시장 중 할랄식품 시장은 연간 1조 4천억 달러로 세계 식품시장의 약 1/3을 차지한다. 할랄산업개발공사 (Halal Development Corporation)의 마스터플랜에 따르면, 말레이시아의 할랄산업은 2020년까지 GDP의 5.8%를 차지할 것으로 예상되고 있다. 국내 식품산업의 새로운 시장 개척과 활성화를 위해 검증된 할랄식품 생산을 통한 세계 할랄 시장으로의 참여가 적극 요구되며 이를 위한 할랄 인증을 위한 할랄식품 검사법의 개발이 필요하다.

 

 

4. Discussion

 Real-time PCR을 통해 식품에 함유된 할랄 성분을 검출하는 실험을 진행하였다. 일반적인 PCR과 달리 rt-PCR은 Probe의 형광량을 측정하는 실험이므로 형광을 보정하는 rox가 사용되었다.

 실험결과에 설명된 Ct값은 절대적인 양이 아닌, sample과의 상대적인 양을 가리킨다. 그러므로 각 식품의 포장지에 적힌 성분함량의 백분율과 결과값이 다르다. 만약 절대적인 양을 측정하더라도, 실험에 사용한 샘플들은 pure 상태가 아닌 ~~ 성분이 섞여 있기 때문에 결과가 낮게 측정될 수 있다. 각 조들의 실험결과를 비교해보면 모든 성분들이 영양성분함량에 모두 검출되었음을 알 수 있다. Real-time PCR을 진행하고 결과를 보면, 성분 함유량이 적은 식품의 경우 Ct값이 늦게 나올 가능성이 있다. 또한 PCR 검출감도에 따라 검출이 되지 않을 수 않아 실제로 성분이 들어 있어도 음성이라고 뜰 수 있다. 실제로는 시료 성분이 없는데 양성이라고 나오는 경우도 존재한다. PCR kit를 사용할 때 30-35 정도로 cycle이 지정되어 있으나, cycle이 과도해지면 Taq polymerase 손상으로 인해 양성으로 검출될 수 있다. 30-35 cycle 이후에 나오는 값들에 대해서는 전기 영동 band를 통해 직접 확인하면 실제로 시료 성분이 들어있는지 여부를 볼 수 있다.

 

 

---

Reference

1) Filion, M. 2012. Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology. Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0

2) Espy, M.J. 2006. Real-Time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin. Microbiol. Rev. 19, 165–256.