제한효소 및 DNA ligation 실험 레포트

1. Title

제한효소를 이용한 plasmid DNA의 절단 및 DNA ligation

 

 

2. Abstract

제한효소(restriction enzyme)는 DNA 분자내의 특정한 염기서열을 인식하고, 인식한 서열 내의, 또는 근처의 특정한 부위에서 double-stranded DNA를 절단하는 endonuclease이다. 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하는 것은 DNA 재조합기술에서 가장 기본적인 과정 중의 하나이다. 이번 실험에서는 pKS plasmid와 pACYC184 plasmid를 제한효소 EcoR1과 Ssp1을 각각 처리하거나, EcoR1+Ssp1을 동시 처리하여 잘려진 단편의 크기와 개수를 비교하고 확인한다. 또한 ligase를 이용하여 insert DNA를 vector DNA에 삽입하는 실험을 진행하였다. EcoR1는 plasmid를 한 번 잘라 한 개의 band가 나왔으며, Ssp1은 두 번 잘라 두 개의 band가 나왔으며, 마지막으로 두 효소를 동시에 처리한 것은 세 번 잘려 세 개의 band가 관찰되었다. Ligation의 경우 band의 윗부분으로 갈수록 두께가 두꺼워지는 것을 알 수 있다. 이를 이용하여 제한효소지도를 그리는 것이 가능하며, 이러한 제한효소지도는 유전자 재조합 결과를 확인하거나 DNA 절편의 대략적인 특성을 알아볼 때 활용할 수 있다.

 

 

3. Introduction

1) 제한효소

 제한효소(restriction enzyme)는 DNA 분자내의 특정한 염기서열을 인식하고, 인식한 서열 내의, 또는 근처의 특정한 부위에서 double-stranded DNA를 절단하는 endonuclease이다. 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하는 것은 DNA 재조합기술에서 가장 기본적인 과정 중의 하나이다. 제한효소의 종류는 다앙하나 일반적으로 많이 사용되는 제한효소는 2형 제한효소(Type II restriction enzyme)이다. HindIII, EcoRI, BamHI이 모두 2형 제한효소이다. DNA 인식서열 내부를 자르며, 자르는 방법에 따라 크게 두 가지 절단 부위가 생긴다.

 

2) Blunt end, Sticky end

 2형 제한효소를 통해 DNA를 절단하는 방법은 두 가지가 있다. 제한효소 Ssp1로 DNA를 자르면 이중가닥의 두 가닥을 동시에 같은 위치에서 자른다. 그 결과로 blunt end가 생긴다. Blunt end는 서로의 끝을 붙잡고 있을 가능성이 적기 때문에 나중에 DNA를 ligase로 붙일 때 시간이 많이 필요하다. 효율이 매우 떨어지며, 고농도 DNA ligase를 필요로 한다. 두 번째로 제한효소 EcoR1는 DNA 두 가닥의 다른 위치를 절단하여 DNA 이중가닥이 비대칭적으로 sticky end가 나타난다. 이런 경우 잘린 부위는 5‘ 말단에 네 개의 뉴클레오티드가 돌출되어 있어 ligation 효율이 높다. 뉴클레오티드 사이에 수소결합이 일어나 상보 sticky 말단이 염기쌍을 이룰 수 있기 때문에 연결이 용이하다.

 

3) 제한효소 지도

 DNA상의 제한효소 절단자리의 위치를 염기서열에 기준하여 그린 지도를 제한효소지도라고 한다. 지도 작성을 통해 genome 등의 염기서열 결정 전단계에 사용되기도 하며, 유전자 재조합이 제대로 일어났는지 확인하거나 유전자 지도와 함께 비교하여 유전자 조합을 하는 단서를 얻을 수 있다. 인식 배열이 다른 여러 가지 제한효소로 절단한 DNA 단편을 아가로오스(agarose)나 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)의 겔 전기영동(gel electrophoresis)으로 분리하면 각각의 제한 효소마다 공통적인 염기서열 말단을 가진 단편이 길이의 차이별로 구분된다. 얻어진 각 단편을 순차적으로 위치 배열함으로써 제한효소 지도를 완성할 수 있다.

 

4) Ligation

 유전자 클로닝 과정 중 재조합 DNA를 만들기 위한 실험으로, 원하는 유전자(insert DNA)를 Vector DNA에 삽입하기 위해서 DNA Ligase를 이용하는 방법이다. Ligase 효소의 작용을 통해 DNA나 RNA의 5` 인산기와 인접한 새로운 DNA나 RNA조각의 3` OH 가 phosphodiester bond를 형성하여 틈이 생긴 DNA나 RNA, 또는 선형형의 두 종류의 DNA나 RNA를 연결하는 작용을 말한다. Ligase는 크게 3가지 종류가 있다. DNA 말단을 서로 연결해주는 DNA ligase, 세균 세포에서 발견되는 세균성 ligase, bacteriophage T4에서 암호화되며 blunt end를 연결해주는 T4 ligase가 있다.

라이신(lysine)의 활성 부위가 아데닐산(ATP)의 α-인 성분을 밀어냄으로서, 피로인산염(PPI)을 방출하고 공)유 지방산을 형성한다. 아데닐산 앞에 있는 틈에서의 ligase-아데닐산의 결합은 해제되고, 5‘틈의 인산염으로 옮겨져서 아데닐산 염화된 틈의 이중구조를 형성한다. 3‘틈의 수산기는 5'틈의 인산염에 달라붙어서 인산 에스테르 결합을 형성하고, 아데닐산이 분리된다.

 

 

3. Discussion

DNA 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하고 ligase를 통해 DNA를 접합하는 실험을 진행하였다. 1번과 5번은 제한효소를 처리하지 않은 plasmid로 supercoiled 형태를 하고 있는 DNA로서 가장 이동성이 크다. 2번과 6번은 EcoR1을 이용하여 plasmid를 한 번 잘라 DNA가 linear 형태로 원래의 size를 나타내고 있다. 3번과 7번은 Ssp1에 의해 plasmid가 두 가닥으로 잘리게 된 것이며, 4번과 8번은 두 가지의 효소로 인해 총 세 가닥으로 잘린 것을 알 수 있다. Ligation의 경우 위쪽으로 갈수록 band가 점점 두꺼워지는 것을 볼 수 있다. 또한 반응 시간이 길어질수록 ligation이 진행되어 band size가 커지는 것을 알 수 있다.

 

 

---

Reference

1) 와타나베 이타루, 바이오테크놀러지 용어사전, 2017, 전파과학사, 381p