Plasmid DNA isolation 실험 레포트

1. Abstract

Plasmid DNA란 세포내에 염색체와는 독립적으로 존재하는 환상의 작은 DNA 분자이다. 세포에서 plasmid DNA를 가져오기 위해서는 chromosomal DNA와 분리를 해야 한다. 이때 주로 alkaline lysis method가 이용된다. 이 method는 세포벽을 파괴하는 solution 1과 chromosomal DNA 변성을 일으키는 solution 2, chromosomal DNA와 엉기게 되어 최종적으로 plasmid DNA를 분리되게 만드는 solution 3으로 이루어진다. 이후 centrifuge 된 용액에 phenol/chloroform을 통해 protein을 변성시키고 isopropyl alcohol과 75% EtOH로 washing 한다. 결과 확인을 위해 agarose gel electrophoresis를 진행하였다. pKS(-)의 plasmid size는 2027bp이하, pACYC는 2322~4361bp 사이로 측정되었다. DNA 형태에 따라 전기 영동 이동도가 달라진다. 또한 chromosomal DNA가 남아 있거나 voltax 등의 과정에서 plasmid가 변형되면 중간에 옅은 bond가 나타날 수 있다.

 

 

2. Introduction

1) Alkaline lysis method

세균에 포함된 두 가지 종류의 DNA를 분리한다.

  (1) Solution 1 : 50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-Cl으로 구성되어 있으며, pH 8.0이다. 세포를 불안정하게 만들고 nuclease를 불활성화 시키는 역할을 한다. EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 Ca2+을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. Vortex 진행 시 강도가 너무 강하면 세포가 완전히 깨지게 되어 chromosome DNA 변성이 일어나지 않는다. 이로 인해 plasmid DNA와 구분할 수 없기 때문에 세포벽만 깨지고 세포는 파괴되기 전 까지만 처리해야 한다.

 

  (2) Solution 2 : 0.2 M NaOH, 1% SDS로 구성되어 있으며 pH는 12.5로 강염기이다.  SDS는 ionic detergent로 cell lysis 역할을 하는데, chromosomal DNA가 변성된다. 그러나 plasmid는 super coil 형태로 매우 작기 때문에 변성이 일어나지 않는다. NaOH로 인한 pH 변화 때문에 DNA와 protein denaturation이 발생한다.

 

  (3) Solution 3 : 29.5 mL glacial acetic acid, 5 M Potassium acetate로 구성되어 있으며 pH 4.8이다.  DNA renaturation 역할을 한다. SDS에 의해 분리된 chromosomal DNA는 potassium acetate에 엉기게 된다. 중성 용액으로 변하면서 plasmid는 형태를 회복하지만 chromosomal DNA는 원래 상태로 돌아오지 못한다.

 

2) Agarose gel electrophoresis

아가로즈 겔은 해상도는 낮지만, DNA 단편을 200 bp에서부터 50 kb까지 분리할 수 있으며 사용이 간편하고, 다루기가 쉽기 때문에 현재 가장 많이 사용되고 있는 전기영동이다. 아가로즈는 해초로부터 추출되는 물질로서 선형 중합체의 형태를 하고 있다. 아가로즈 겔은 적당한 완충용액(TAE buffer)에 녹여 서 원하는 크기의 틀에 부어지며, 겔이 굳은 후에 사용된다. 겔이 굳는 동안 아가로즈는 지지체(matrix) 형태가 되며, 그 밀도는 아가로오스의 농도(%)에 따라 정해진다. 이러한 겔에 전기장이 주어지면, 음전하 를 띠는 DNA는 양극으로 이동한다. 이때 DNA가 이동하는 정도는 여러 가지 요인의 영향을 받는다.

DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다. Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다. DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다. 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.

 

 

3. Discussion

Transformation된 colony를 통해 plasmid DNA를 정제하고 실험을 진행하였다. 이때 alkaline lysis method를 이용하였는데 세 가지의 solution을 사용하였다. Solution 1, 2, 3를 가할 때 강한 voltaxing을 하지 않도록 유의해야 한다. solution 1을 가했을 때 아이보리색을 띠는 용액이 solution 2에 의해 투명해지고 점도가 생겼다가 solution 3에 의해 chromosomal DNA가 엉기게 된다. Phenol/Chloroform은 protein을 변성해서 제거하는 역학을 하며 Isopropyl alcohol과 75% Ethanol은 DNA 침전 용도로 사용되었다. Isopropyl alcohol은 ethanol보다 용해도가 낮지만 DNA 분리율이 높으며, ethanol은 용해도가 높으므로 salt 제거에 용이하다.

DNA 형태에 따라 전기 영동 이동도가 달라진다. Super coiling 형태의 경우 가장 이동도가 좋으며, Linear와 relaxed 형태에서는 각각 DNA가 두 가닥, 한 가닥 씩 끊긴 DNA는 이동도가 낮다. 각 조들의 실험결과를 비교하면 비슷한 범위에서 측정이 되었다. 그러나 super coiled 형태이기 때문에 size 차이 상쇄가 어려워 정확한 size를 알기 어렵다. pKS는 3조에서 가장 크기가 작게 나왔고 pACYC는 3조에서 가장 크기가 작게 나왔고 2조에서 가장 크게 나왔다. pKS와 pACYC 모두 흐릿하게 보이는 부분들이 있는데, 이는 chromosomal DNA가 남아있는 부분이다. 또한 중간에 작은 band들이 보이는데 이 부분들은 voltax 단계 등에서 plasmid가 변형되어 생긴 것으로 추측된다.