PCR을 이용한 GMO의 정성분석 실험 레포트

1. Introduction

1) PCR(원리, primer)

 PCR은 유전자를 증폭하는 방법으로 이미 알고 있는 일부의 염기서열 중 특정 DNA 부위를 반복 합성하여 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법이다. 이 방법은 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA합성이 가능하다. PCR을 진행하기 위해서 총 2개의 primer가 필요하다. Primer란 leading strand에 결합하여 PCR의 시발점 역할을 하는 짧은 DNA 조각이다. Target DNA와 상보적으로 결합을 하여 DNA 합성이 시작된다. PCR은 보통 25~ 35 cycle로 실시하는데, 30 cycle의 경우 2의 30 제곱만큼의 DAN가 증폭하게 된다.

 PCR 과정은 총 3단계로 이루어진다. 첫번째로 double strand DNA가 single strand로 변성되는 denaturation이 일어난다. 이때 thermocycler를 이용하여 95도씨 정도의 온도로 유지하면서 열에 강한 Taq polymerase를 사용하며 GC content에 따라 온도가 변하기도 한다. 두번째는 primer가 leading strand에 결합하는 annealing이 일어난다. 온도는 50-60도씨 사이로 첫번째 단계에 비해 온도가 가변적이다. 온도는 주로 primer의 길이 및 Tm, GC content에 따라 결정된다. 마지막으로 polymerase에 의해 새로운 DNA 가닥이 신장되는 extention이 일어난다. DNA polymerase의 최적 온도인 72도씨 정도에서 1-2분간 반응이 일어난다.

 

2) GMO

 GMO(Genetically modified organism)은 유전자재조합생물체로서 생물체의 유전자 중 특정 유전자를 취하여 그 유전자를 갖고 있지 않은 생물체에 삽입해 새로운 성질을 갖도록 한 것이다. 이와 같이 유전자 재조합 기술을 활용하여 재배된 농산물, 축산물 등 및 이를 원료로 하여 가공된 식품들 중 정부가 안전성을 평가하여 입증이 된 경우에만 식품으로 사용할 수 있으며, 이를 ‘유전자 변형 식품’ 이라고 한다.

 GMO는 외래 DNA를 삽입한 형태로 항시 발현하는 유전자를 사용해야 한다. 식품공전에서는 이러한 이유로 promoter와 terminator를 사용하여 대부분의 GMO를 만들어낸다. Promoter는 언제나 gene이 발현되게 하며 종 간 특이성이 적으므로 적용이 쉽다.

 GMO를 반대하는 입장들도 많으며, 각 나라에서는 GMO 식품을 표기하도록 하고 있다. 'Non-GM 식품'이란 Non-GMO를 원료로 한 식품을 의미한다. 우리나라는 GMO의 비의도적 혼입을 3% 이하로 구분하여 유통 · 관리할 경우 GMO 표기는 하지 않아도 되지만 Non-GMO 표기는 할 수 없다. 우리나라에서 Non-GMO라고 함은 GMO의 혼입이 0%인 경우에만 한한다. 그러나 다른 제품에 대한 불필요한 오해를 일으킬 수 있어 Non-GM 식품이라는 표시를 권장하지 않는다.

 

3) GMO 이용사례

 GMO가 이용되는 가장 대표적인 분야는 농작물이다. 1994년 미국 FDA에서 승인된 무르지 않는 토마토, 1995년 승인된 제초제 내성 콩이 대표적이다. 1996년 GM 콩이 본격적으로 재배되기 시작한 이후, 현재는 전세계적으로 재배되고 있다. 여러 식품 중 4대 작물(옥수수, 밀, 쌀, 보리)에서는 GMO가 대부분을 차지할 것이라고 예측된다. 제초제 내성, 해충 저항성이 기존의 GMO을 대표하는 특성이었던 것에 비해, 비타민 함량 강화, 트랜스 지방산 감소, 가뭄 스트레스에 견디는 특성, 식물병에 견디는 특성, 곰팡이에 견디는 특성 등 GMO의 종류도 점차 다양화되고 있다.

 생명, 의료 분야에서도 GMO가 다양하게 이용되고 있다. 항원, 항체 등 유전자재조합 단백질을 생산하는 데에도 활용된다. 주사 접종 대신에 식물을 섭취해 병을 예방·치료하고자 하는 '분자약농(Molecular pharming)' 분야에서는 옥수수, 시금치, 담배, 양상치, 토마토, 콩, 감자, 바나나 등에서 여러 질병의 백신을 생산하는 연구가 진행되고 있다.

 

4) GMO 분석법

 GMO의 주요 검출방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이 국제 표준분석법으로 추천되고 있다. 식품공전에서는 곡류나 두류와 같은 농산물이나 단순 분쇄 가공 농축산물의 경우 재조합 유전자와 외래 단백질의 분석방법을 모두 적용할 수 있으나, 가공식품의 경우 제조․가공과정 중 단백질의 변성, 분해 등으로 인해 단백질 분석방법이 아닌 재조합 유전자의 분석방법을 적용한다고 설명하고 있다.

 외래 단백질 분석방법으로 효소연결면역흡착검사법(Enzyme-Linked Immunosorb ent Assay, ELISA)이나 lateral flow strip과 같은 간이신속검사키트를 이용할 수 있다. 재조합 유전자 분석방법으로 정성분석은 일반 PCR 장치 또는 실시간 PCR (Real-Time PCR) 장치를 이용하며, 정량분석은 실시간 PCR 장치를 이용한다. 다만, 농축산물과 단순 분쇄 가공 농축은 재조합 유전자의 정성분석과 정량분석이 모두 적용 가능하나, 가공식품은 정량분석방법이 확립될 때까지는 정성분석만 적용한다.

 표준품 확보가 불가능한 유전자변형식품의 경우 증폭산물의 확인으로 결과를 판정할 수 있다. 정성분석은 일반 PCR 장치를 이용하며, 추출된 DNA를 주형 DNA (template DNA)로 하여 검색하고자 하는 DNA의 프라이머를 이용하여 DNA를 증폭한 후 전기영동에 의하여 증폭된 DNA를 확인한다.

 

 

2. Results

치킨스톡에서 NOS, 35S, Beta-actin이 모두 검출되었으므로 유전자변형 대두가 들어 있고, 또띠아칩에서 NOS, 35S, zein이 모두 검출되었으므로 유전자변형 옥수수가 들어 있다는 것을 알 수 있다.

 

 

3. Discussion

 Conventional PCR을 이용하여 식품 내에 포함된 GMO 검출 및 정성 실험을 진행했다. 각sample별로 forward(F) primer, reverse(R) primer를 포함하여 primer를 총 3개씩 넣어주었다. F, R primer는 polymerase가 새로운 strand를 합성하고자 할 때 복제를 도와주는 역할을 하며, 이를 위해 증폭하고자 하는 부위의 양쪽 끝 염기서열을 알고 있어야 한다. 그 외 사용한 primer는 35S promoter primer, NOS terminator primer, beta-actin primer, zein primer이다. Beta-actin primer는 콩의 내재성 유전자이며, zein primer는 옥수수의 내재성 유전자이다. 각 primer design에 따라 band의 size가 변할 수 있으므로 크기를 잘 알고 있어야 한다. Taq DNA polymerase는 내열성 DNA 중합효소로서 열에 강한 특성을 지니고 있으며 primer가 연장을 도와 DNA를 합성하는 역할을 한다. dNTP(deoxynucleotide)는 DNA를 합성하는 재료로서 DNA polymerase가 DNA를 합성하는데 필요한 에너지를 제공하는 역할을 한다. 또한 template DNA는 양이 과다하면 PCR 반응을 저해시키므로 주로 1000ug이하로 사용해야 한다.

 각 조별 결과를 비교해보면, 모두 유전자변형 대두와 옥수수가 검출된 것을 알 수 있다. 내재성 유전자는 검출되었으나 NOS나 35S가 나오지 않은 결과들이 있다. NOS와 35S가 모두 검출되지 않은 식품은 GMO가 아닐 수도 있다. 또는 GMO를 포함하고 있어도 모든 GMO 식품들이 NOS, 35S를 사용하는 것이 아니므로, 해당 식품들은 다른 종류의 promoter나 terminator를 사용하였기 때문에 검출이 되지 않은 것으로 추측된다. 실제 식품공전에서는 각 추출 DNA에 대한 PCR을 2회의 확인시험을 하여 GMO를 확인한다. 1차 확인시험에서는 이번 실험과 같이 내재유전자와 전사개시인자(promoter 35S) 및/또는 전사종결인자(transcription termination factor)에 대한 primer로 PCR을 실시한다. 그 결과 2 반복 추출 DNA 중 내재성 유전자 특이 PCR 산물이 확인된 DNA에서의 35S 프로모터와 NOS 종결인자(terminator)의 검출 결과에 따라 다음의 유전자변형 증폭산물크기 대한 2차 확인시험이 필요하다. 35S와 NOS, 특이 PCR 산물이 확인된 경우, 35S와 특이 PCR 산물만 확인된 경우, NOS와 특이 PCR 산물만 확인된 경우, 35S와 NOS와 특이 PCR 산물이 모두 확인되지 않은 경우 총 4가지로 나누어 각기 다른 primer를 활용하여 시험을 진행한다.

 

 

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Reference

1) 신공식 외 5인, GMO 유전정보 조사분석 및 판별기술 개발 연구, 2012, 농촌진흥청, 10-13p

2) 식품공전, 2021, 식품의약품안전처, 제 8.일반시험법 10. 식품표시 관련 시험법 10.1 유전자재조합식품의 시험법