SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis에 의한 단백질의 분리 예비레포트

1. Introduction

 1) 전기영동(electrophoresis)

 단백질의 아미노산 결합, 3차원적 구조, 반응 메커니즘을 이해하기 위해서는 먼저 원하는 단백질을 분리 및 정제해야 한다. 이때 전기영동 방법을 이용하여 단백질을 분리할 수 있다. 전기영동이란 수용액상에서 전하를 갖는 분자(단백질, 핵산 등)가 전기장 내에서 지지체(polyacrylamide gel, agarose gel)를 통해 이동하는 현상이다. 단백질을 전기장 하에 각각 다른 속도로 이동하는 방법을 이용하여 분리한다. 단백질의 이동 속도는 단백질 분자량, 단백질의 전하, 단백질의 모양에 영향을 받는다. 전기영동을 한 후에 단백질에만 결합하는 Coomassie blue와 같은 색소로 염색하면 분리된 단백질을 눈으로 확인할 수 있다. 전기영동법에는 겔 전기영동, 단백질의 pI를 이용하는 등전점 전기영동, 앞의 두 가지 방법을 모두 활용한 이차원전기영동 등이 있다.

 

 

 2) Polyacrylamide gel

 Polyacrylamide gel은 acrylamide와 bisacrylamide로 만들어지며, 다공성 구조를 형성함으로써 체의 역할을 한다. Gel의 작은 구멍을 통해 단백질들이 size에 따라 정렬된다. 구멍의 크기는 acrylamide와 bisacrylamide의 상대적인 비율에 따라 정해진다. 산소에 의해 이 둘의 중합반응이 방해될 수 있기 때문에 polyacrylamide는 공기를 차단하기 위해 2장의 유리판 사이에 gel을 부어서 만든다. 단백질들이 모두 (-) charge를 띠고 있기 때문에 전장을 걸어주면 (+) 쪽으로 이동하고, 작은 size의 분자는 polyacrylamide의 공간을 쉽게 통과하므로 큰 분자보다 더 빠른 속도로 이동할 수 있다.

 

 

 3) SDS-PAGE(원리, 작용, stacking gel, separating gel)

  (1) 원리 및 작용

   SDS-PAGE의 목적은 단백질을 분자량의 차이를 이용하여 분리하는 것이다. Buffer 용액을 통해 아미노산의 모양을 사슬형으로 변형하고, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)와 결합을 하면 모든 단백질은 본래의 고차원 구조가 변성되어 전체적으로 negative charge를 띠게 된다. 이에 따라 단백질의 이동 속도에 전하와 모양이 영향을 주지 않고 단백질의 분자량에 의해서만 속도가 달라진다. 변성시킨 단백질에 전장을 걸어주었을 때 size의 차이에 따라 분리되도록 하는 것이 PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)다. 이때 위, 아래의 단백질의 속도를 상쇄시키기 위해 gel을 불연속적으로 만들어 진행한다. 작은 size의 단백질은 gel를 빠르게 통과하지만, 큰 단백질은 혼합물 주입위치에 가까운 상단에 존재한다.

 

  (2) Stacking gel

   Stacking gel은 Glycine 이온의 알짜전하가 0이 되는 pI 값은 5.97인 반면 stacking gel의 pH는 6.8이기 때문에 Cl-와 glycine 사이 이동속도 차이가 생긴다. Cl-, glycine, proteins 모두 음전하를 띄지만 Cl-은 분자량이 가장 작고 음전하가 가장 강하므로 가장 속도가 빠르고, glycine은 알짜전하에 가까운 가장 약한 음전하를 가지므로 이동속도가 가장 느리다. 이때 이온들 사이의 전기장이 발생하여 Cl-(low voltage gradient)과 Gly-(high voltage gradient)의 속도 차이가 없어진다. 또한 용액을 납작하게(stacked) 만들어 거의 동일한 속도로 내려가 running gel(separating gel)에 들어가기 전 같은 출발선상에 일직선으로 위치하게 된다.

 

  (3) Separating gel

   Running gel은 stacking gel과는 달리 pH 가 8.8이기 때문에 glycine이 완전히 이온화된다. 이동속도가 Cl-, glycine, protein으로 바뀌게 되어 두 이온 사이의 voltage gradient 차이가 없어진다. 각 단백질마다 분자량 차이에 의해 이동속도가 달라지게 된다. 또한 stacking gel에 비해 acrylamide의 농도가 높아져 gel 구조가 촘촘해지므로 단백질들의 이동속도차이를 더욱 높인다.

 

 

 4) 효소의 size

 효소의 종류에 따라 분자량이 다르며 효소의 크기는 20~160,000 kDa이다. 같은 효소라고 하더라도 발현되는 생물에 따라 크기가 다양하다. 다른 실험을 참고하면, alpha amylase의 크기는 10-210 kDa로 다양하며 E.coli에서 발현되는 alpha amylase 크기는 53kDa로 beta glucanase는 27kDa로 나왔다. 또한 SDS-PAGE로 추정한 protease는 46kDa, amyloglucosidase의 크기는 101kDa로 나왔다. 이와 같이 다른 효소의 크기를 활용하여 SDS-PAGE로 standard marker와 미지시료의 효소 크기나 발현량을 비교할 수 있다. 크기가 작은 효소는 빠르게 내려와 아래 부분에, 크기가 큰 효소는 위에 위치해 있다.

 

 

 

 

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Reference

1) 양성렬, 인체생화학, 포널스출판사, 2015, 27-28

2) 생화학분자생물학회, 생화학백과, 생화학분자생물학회, 2019, 1193

3) O. R. Adeoyo, B. I. Pletschke, J. F. Dame. Purification and characterization of an amyloglucosidase from an ericoid mycorrhizal fungus (Leohumicola incrustata). 2018. AMB Express. vol8: 154.

4) Mehta Deepika, Satyanarayana Tulasi. Bacterial and Archaeal α-Amylases: Diversity and Amelioration of the Desirable Characteristics for Industrial Applications. 2016. Frontiers in Microbiology vol7: 1129.

5) Musa, M., Radman, M. & Krisko, A. Decreasing translation error rate in Escherichia coli increases protein function. 2016. BMC Biotechnol 16, 28.