분광광도계 및 단백질 정량분석 예비레포트

1. Title

Spectrophotometer의 원리 및 이를 이용한 단백질의 정량분석

 

2. Introduction

 

1) 분광광도계(Spectrophotometer)

 물체에 빛을 가하면 빛은 물체에 반사 및 흡수되거나 통과된다. 이때 물체의 농도와 파장을 통해 물체에 의해 흡수되는 빛의 양이 결정된다. 물체가 빛을 흡수하는 정도를 흡광도라고 부르며, 흡광도를 측정하는 기기를 분광광도계(Spectrophotometer)라고 한다. 시료의 화학적 특성마다 흡수되는 빛의 양이 다르기 때문에 분광광도계를 통해 이를 활용한 분석이 가능하다. 즉, 빛의 흡수 정도를 파악하면 용액 중에 있는 빛을 흡수하는 화학물질의 양을 정량 할 수 있다. 이런 종류의 실험에 주로 사용하는 빛은 자외선(ultraviolet, 180~320nm) 및 가시광선 (visible, 320~800) 영역에 해당한다. 분광광도계는 다음과 같은 구조로 되어 있다.

 

(1) 광원(Lamp): 필요한 파장에 따라 일정한 빛을 낼 수 있는 전구를 사용하며, 자외선(UV) 영역의 광원에서는 아크램프(Deuterium)를 사용하고 가시광선(Vis)영역에서는 텅스텐(Tungsten)램프를 사용한다.

(2) 단색화장치(Monochromator): 원하는 파장을 선택하는 장치로써, 광원에서 나오는 넓은 파장의 빛을 단색 복사선으로 바꿔 원하는 파장의 빛만 사용할 수 있게 한다.

(3) 검출기(Detector): 샘플을 통과한 빛을 검출하여 측정값을 나타내 주는 장치이다.

 

 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정할 때 큐벳(Sample cuvette)을 넣어준다. 큐벳의 세로선은 분광광도계 큐벳 고정대의 세로선에 일치하게끔 놓아야 한다. 또한 큐벳에 지문, 용매 등 오염물질이 묻어 있는 등의 경우에 흡광도에 영향을 줄 수 있기 때문에 큐벳이 깨끗한 것을 확인하고 사용해야 한다.

 큐벳 외에도 표준 용액(standard solution)을 사용하는데, 표준 용액은 흡광물질을 제외하고 시료 용액과 반드시 동일한 성분이 유지될 수 있도록 만들어야 한다. 추가적으로 분광광도계는 반드시 빛의 투과율(%T)을 보정한 후에 사용하여야 한다.

 

2) Lambert-beer 법칙

 Beer는 시료의 흡광도는 시료에서 빛을 흡수하는 화학종의 농도에 비례함을 밝혔고, 람베르트(J. H. Lambert)는 시료의 흡광도는 시료의 두께에 비례함을 보였다. 따라서 Beer-Lambert 법칙은 위의 두 가지 내용을 합쳐서 기술한 것이며 흡광도를 구하는 식은 아래와 같다. (A=흡광도, I0=물체에 입사하는 빛의 세기, I=물체를 투과한 빛의 세기) (ε=분자흡광계수, c=몰농도, d=흡수층의 두께) 흡광도는 물질의 농도와 두께가 비례하며 농도가 진해질수록(Beer), 두께가 두꺼워질수록(Lambert) 흡광도가 커진다.

 

 

3)    단백질 정량법 종류

- Bradford Method

 Bradford 법은 Coomassie Blue G dye의 세가지 형태의 평형에 기초한다. 강산 조건에서 이 염료는 2개의 H+을 얻어 양이온 형태에서 red를 나타내나 단백질과 결합하게 되면 H+을 잃어버리고 음이온 형태가 되어 blue을 띄게 된다. 이로 인해 염료의 최대 흡광도가 595nm로 변하게 되며, 결합체가 많아질수록 blue가 진하게 나타난다. 이 방법은 발색반응이 2분 이내에 완결되며 비단백질 성분들에 의한 방해도 거의 없으며 감도가 좋다. (검출농도: 2 ug/mL to 120 ug/mL)

 

- Direct measurement of UV absorbance

 자외선(UV)을 사용하며, 방향족 아미노산에 의해 최대 흡광도인 280nm를 이용한 방법이다. 시료를 넣고 자외선에 노출시키면 최외각전자에 변화가 일어나 들뜬 상태(excited state)가 되어 빛을 흡수한다. 분자의 구조를 밝히는 데는 결정적이지 못하며, 주로 파이 전자계를 확인하는데 사용된다.

 

- BCA Method

 BCA method는 단백질이 구리 이온을 환원시키는 성질을 이용한다. Cu2+이온이 단백질과 BCA(Bicinchoninic acid)에 의해 Cu+이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색된다. 이때 빛의 흡수율이 단백질 농도에 영향을 받기 때문에 분광광도계를 통해 562nm 파장에서 흡수율 차이를 측정할 수 있다.

 단백질의 양과 화합물의 양이 비례하기 때문에, 단백질의 양이 많아지면 흡수율이 증가한다. 다만, 단백질 농도에 따른 표준 흡수율 데이터(Standard curve)가 있어야 결과 값을 측정할 수 있다. 간단한 단일 시약을 이용하여 실험이 가능하고 아미노산 조성에 상관없이 발생정도가 일정하다는 장점이 있으나, 반응이 느려 시간이 걸리며, 단백질 변성 가능성이 있다는 단점이 있다.

 

- Biuret Method

 단백질에 대해 재현성이 높은 방식이며 1~20mg의 단백질을 정량하는데 사용되는 방법이다. 알칼리용액에서 Cu2+-protein complex를 형성시켜 Cu+로 환원된다. 뷰렛은 알칼리성 CuSO4와 반응하여 보라색 착화합물*이 만들어진다. 이러한 보라색 용액은 540-560nm 파장에서 측정 가능하다. 착화합물의 색은 1~2시간가량 안정하지만, 그 이후에는 색도가 점점 증가하고 감도가 낮다.

* 착화합물 : 비공유 전자쌍을 가지고 있는 분자가 양전하를 띤 이온이나 전자가 부족하여 오비탈이 비어있는 원자와 함께 전자를 공유하는 결합인데 이때 배위 결합을 하는 모든 화합물들을 배위 화합물이라 한다. 즉, 하나의 원자에 몇 개의 이온 또는 원자가 배위하여 생긴 화합물이다.

 

- Lowry Method

 단백질 아미노산에서 구리이온이 환원되는 정도를 측정하는 방법이다. Cu2+이 펩티드 결합과 반응하며, 포스포몰리브덴산이 포함된 시약이 tyr, tryp에 의해 환원되어 청색이 나타난다. 단백질 종류에 따라 아미노산의 함량이 다르기 때문에 색의 세기가 일정하지 않다. 감도가 좋다는 장점이 있으나, 화학물질들에 의해 방해 받기 쉬우며 준비 과정과 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.

 

 

 

 

---

Reference

- Owusu-Apenten, Food Protein Analysis: Quantitative Effects On Processing, 2002, CRC Press, 105p

- John E. McMurry, Robert C. Fay, 일반화학 Atoms First[2판], 2014, 자유아카데미

 

그 외 참고

- https://www.scienceall.com/%eb%b0%b0%ec%9c%84-%ed%99%94%ed%95%a9%eb%ac%bc-coordination-compound-%e9%85%8d%e4%bd%8d%e5%8c%96%e5%90%88%e7%89%a9/

- https://m.blog.naver.com/ihyeo55/221336373436

- https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5827805&cid=62802&categoryId=62802

- https://m.blog.naver.com/PostView.naver?isHttpsRedirect=true&blogId=fishsun33&logNo=221397922404

- https://m.blog.naver.com/PostView.naver?isHttpsRedirect=true&blogId=wellduo33&logNo=221216974666

- https://m.blog.naver.com/PostView.naver?isHttpsRedirect=true&blogId=kdrbiotech&logNo=152795406