분광광도계 및 단백질 정량분석 결과레포트

1. Abstract

 단백질 내 아미노산의 미지시료의 단백질 농도를 구하기 위해서 Bradford 법과 UV 법을 이용하였다. Bradford 법은 Coomassie Blue G dye의 세가지 형태의 평형에 기초하고 단백질 농도가 많아질수록 파란색이 짙게 나타나며, 다른 정량법들에 비해 감도가 좋은 편이다. UV 법은 주로 방향족 아미노산을 들뜬 상태로 만들어 흡수되는 빛의 양을 측정한다. Lambert-Beer 법칙에 기반하여 시료들의 흡광도 standard curve를 그렸다. 그래프의 추세선을 추정하여 미지시료 흡광도에 따른 단백질 농도를 구하였다. Bradford법의 미지시료 단백질 농도는 53.61ug/ml로 나왔으며, UV법의 미지시료 단백질 농도는 0.21mg/ml로 나왔다.

 

2. Results

 Bradford법에서 Bradford염료 시약을 넣었더니 붉은색의 용액이 파란색으로 바뀌었다. 단백질 농도가 높아질수록 파란색이 더욱 진해지는 것을 알 수 있다. UV법 측정 시료는 염색 반응을 하지 않기 때문에 투명하다.

 Bradford 법의 standard curve를 그리면, 기울기는 0.0074이고 R제곱값(결정계수)는 0.964이다. 그래프에서 x값은 단백질 농도를 뜻하고 y값은 흡광도를 뜻한다. 미지시료 흡광도 0.464를 y 값에 넣고 역으로 x값을 계산하면 미지시료의 농도가 나온다.

 UV 법의 standard curve를 그리면, 기울기는 0.4643이고 R제곱값(결정계수)는 0.9983이다. 그래프의 x와 y값이 뜻하는 바는 Bradford 법과 동일하다. 미지시료 흡광도 0.103을 y 값에 넣고 역으로 x값을 계산하면 미지시료의 농도가 나온다.

 

3. Discussion

 단백질 아미노산의 특성을 이용하여 두 가지 단백질 정량법을 진행하였다. 그 중 Bradford 법에서 단백질 농도가 높아질수록 파란색이 진해지는 것을 알 수 있다. 그 이유는 단백질 양이 증가할수록 단백질-dye 복합체의 수가 증가하기 때문이다.

 Bradford 법에서 다른 결과값에 비해 단백질 농도가 60일 때 흡광도 결과값이 추세선과 차이가 많이 나는 것으로 보인다. 이는 시료 투여하고 희석할 때 BSA가 더 많이 들어 갔거나 D.W.가 조금 덜 들어간 것으로 추측할 수 있다. 피펫 사용 시 용액에 기포가 들어가면 용액의 양에 변화가 생기기 때문이다. 그 외에 Spectrophotometer를 사용할 때 주의해야할 사항이 있다. 1) cuvette을 끝까지 끼워 넣지 않으면 마이너스 값이 나온다. 그러나 black보다 투명한 시료를 넣어 측정한다면 마이너스 값이 나올 수 있다. 2) Cuvette을 사용하기 전과 후에 물>알코올>물 순서로 세척한다. 투명한 시료를 사용할 때는 중간 과정에서 물로만 세척해도 되지만, 색을 띄는 시료의 경우 시료를 교체할 때에도 물>알코올>물 순서대로 세척을 해야 한다. 3) Blank 용액 먼저 측정을 한다. (Abs 값: 0) 그 다음에는 농도가 낮은 용액부터 높은 용액 순으로 측정을 해야 한다. 4) 빛이 매우 예민하기 때문에 Road 버튼을 여러 번 눌러보며 흡광도 결과값의 평균을 사용한다.